Новое в клонировании ДНК. Методы

Автор(ы):Под ред. Гловера Д.
30.05.2010
Год изд.:1989
Описание: Книга авторитетного коллектива авторов из Англии, США и ФРГ — третий том практического руководства по молекулярной биологии и генной инженерии. Настоящая книга представляет собой сборник методических разработок, охватывающий широкий спектр современных подходов к молекулярному клонированию и экспрессии генетического материала. Сборник включает десять самостоятельных глав, написанных авторами, работающими в ведущих медико-биологических центрах США, Великобритании и ФРГ. Книга предназначена для молекулярных биологов, генетиков, биотехнологов.
Оглавление:
Новое в клонировании ДНК. Методы — обложка книги.
От редактора перевода [5]
Предисловие [7]
Список авторов [10]
Глава 1. Применение плазмид, содержащих промоторы, специфические для фаговых РНК-полимераз. Питер Ф. Р. Литтл и Йэн Дж. Джексон (Peter Г. R. Little, Ian J. Jackson) [12]
  1.1. Краткое содержание главы [12]
  1.2. РНК-полимеразы бактериофагов [12]
    1.2.1. Основные положения [12]
    1.2.2. В чем преимущество РНК-зондов? [13]
      1.2.2.1. Уникальные свойства РНК-зондов [13]
    1.2.3. Выбор векторов [16]
      1.2.3.1. Выбор клонируемого сайта [16]
      1.2.3.2. Выбор сайта терминации транскрипта [18]
    1.2.4. Выбор РНК-полимеразы [18]
  1.3. Методы [19]
    1.3.1. Получение ДНК-матрицы [20]
    1.3.2. Реакция транскрипции [21]
    1.3.3. Получение немеченой РНК или РНК с низкой удельной радиоактивностью и использование других изотопов и альтернативных меток [25]
    1.3.4. Методические трудности [26]
      1.3.4.1. Нуклеозидтрифосфаты (NTP) [26]
      1.3.4.2. ДНК-матрица [26]
      1.3.4.3. Возможные неудачи при синтезе полноразмерных транскриптов [27]
  1.4. Использование РНК-зондов [27]
    1.4.1. Гибридизация по Саузерну [28]
    1.4.2. «Нозерн»-гибридизацня [29]
    1.4.3. Защита от РНКазы [30]
      1.4.3.1. Методика [30]
      1.4.3.2. Определение содержания РНК в опытах по защите от действия РНКазы [33]
  1.5. Специальные методы [35]
    1.5.1. Гибридизация in situ [35]
    1.5.2. Биологическая активность РНК, синтезированной in vitro [36]
      1.5.2.1. Кэпирование и трансляция [36]
      1.5.2.2. Другие функции РНК [36]
    1.5.3. Специальные методы картирования; «прогулка по геному» [37]
    1.5.4. Секвенирование РНК-транскриптов [37]
  1.6. Заключение [38]
  Литература [38]
Глава 2. Выбор и использование космидных векторов. Питер Ф. Р. Литтл (Peter F. R. Little) [40]
  2.1. Введение [40]
    2.1.1. Краткое содержание главы [40]
    2.1.2. Космидные векторы [40]
    2.1.3. Выбор векторов [41]
      2.1.3.1. Лекарственная устойчивость [41]
      2.1.3.2. Репликон [42]
      2.1.3.3. Сайты рестрикции [42]
    2.1.4. Стратегия клонирования [43]
      2.1.4.1. Выбор ферментов для клонирования [43]
      2.1.4.2. Процедура клонирования [43]
  2.2. Методы [44]
    2.2.1. Получение ДНК для клонирования [44]
      2.2.1.1. Выделение ДНК из клеток или тканей [44]
      2.2.1.2. Частичный рестриктазный гидролизат [44]
      2.2.1.3. Очистка фракции 30—50 т. п. н. частичного гидролизата в градиенте концентрации сахарозы [46]
      2.2.1.4. Обработка фосфатазой [47]
    2.2.2. Приготовление вектора [47]
    2.2.3. Реакция лигирования [49]
    2.2.4. Упаковка [50]
    2.2.5. Высев библиотеки [50]
      2.2.5.1. Выбор клеток [50]
      2.2.5.2. Подготовка клеток [51]
      2.2.5.3. Адсорбция упакованных космид на Е.coli [51]
      2.2.5.4. Эффективность процедуры клонирования [51]
    2.2.6. Рассев библиотеки [52]
      2.2.6.1. Высев на агар для амплификации библиотеки [52]
      2.2.6.2. Высев непосредственно на фильтры [52]
      2.2.6.3. Получение реплик для скрининга библиотеки [53]
    2.2.7. Скрининг фильтров с космидными клонами [53]
    2.2.8. Хранение космидных библиотек [56]
      2.2.8.1. Хранение бактерий [56]
      2.2.8.2. Хранение упакованных космид [56]
      2.2.8.3. Упаковка космидной библиотеки с использованием суперинфекции [56]
      2.2.8.4. Упаковка индивидуальных космид с использованием суперинфекции [57]
      2.2.8.5. Переупаковка путем высева первичной библиотеки на хелперный штамм [57]
      2.2.8.6. Хранение ДНК [59]
    2.2.9. Получение космидной ДНК [60]
      2.2.9.1. Размножение бактерий [60]
      2.2.9.2. Мини-препараты [60]
      2.2.9.3. Препаративное выделение из культур объемом 500—1000 мл. [61]
  2.3. Специальные методы [61]
    2.3.1. Клонирование с помощью рекомбинации [62]
    2.3.2. Cos-картиравание [63]
    2.3.3. «Прогулка по геному» [65]
    2.3.4. 0,2%-ные агарозные гели [67]
  2.4. Проблемы [68]
    2.4.1. Исходная ДНК [68]
    2.4.2. Сахарозные градиенты [69]
    2.4.3. Неудачное лигирование или упаковка [69]
    2.4.4. Высеваемые клетки [69]
    2.4.5. Высев [70]
    2.4.6. Дифференциальный рост космид [70]
    2.4.7. Проблемы, связанные с вектором [71]
      2.4.7.1. Нестабильные последовательности [71]
      2.4.7.2. Неслучайная представленность клонов [71]
  2.5. Заключение [72]
  Литература [72]
Глава 3. Генетические подходы к клонированию, модификации и характеристике индивидуальных космидных библиотек клонов. Анна-Мария Постка и Ханс Лерах (Annemarie Poustka, Hans Lehrach) [74]
  3.1. Введение [74]
  3.2. Работа с космидными клонами, полученными путем упаковки in vivo [74]
  3.3. Отбор космид с помощью гомологичной рекомбинации [77]
    3.3.1. Гомологичная рекомбинация в клетках Е. coli может применяться в качестве метода, альтернативного гибридизации колоний [77]
    3.3.2. Принципы космидно-плазмидной рекомбинации [78]
    3.3.3. Отбор рекомбинантов [78]
    3.3.4. Векторы [80]
    3.3.5. Штаммы [81]
    3.3.6. Генетическая селекция клонов [82]
    3.3.7. Модификация клонов [84]
  3.4. Методики [86]
    3.4.1. Конструирование космидных библиотек [86]
    3.4.2. Упаковка in vivo [89]
    3.4.3. Рекомбинация космид [90]
  Литература [94]
Глава 4. Выделение эукариотических полипептидов, продуцируемых в клетках Е. coli. Файона А. О. Марстон (Fiona А. О. Marston) [95]
  4.1. Введение [95]
    4.1.1. Векторы, используемые для экспрессии [96]
    4.1.2. Методы экспрессии [98]
  4.2. Методы лизиса клеток [99]
    4.2.1. Полный лизис клеток [99]
    4.2.2. Получение сферопластов [100]
  4.3. Нерастворимые белки [100]
    4.3.1. Выделение белковых включений [101]
      4.3.1.1. Центрифугирование [101]
      4.3.1.2. Методы отмывки включений [102]
    4.3.2. Подходы к расщеплению гибридных белков [104]
      4.3.2.1. Химическое расщепление [105]
      4.3.2.2. Ферментативное расщепление [107]
    4.3.3. Гибридные белки, рассчитанные на специальные процедуры выделения [112]
    4.3.4. Растворение белков, синтезируемых клетками Е. coli в чистом виде и в виде гибридных белков [116]
    4.3.5. Ренатурация [119]
    4.3.6. Примеры растворенных и ренатурированных эукариотических полипептидов, выделенных из клеток Е. соli [122]
  4.4. Растворимые белки [128]
    4.4.1. Внутриклеточная экспрессия [128]
    4.4.2. Секреция [131]
  4.5. Заключительные замечания [133]
  4.6. Приложение [135]
  Литература [136]
Глава 5. Получение и очистка поликлональных антител к гетерологичным фрагментам гибридных белков, содержащих B-галактозидазу. Син Б. Кэрролл и Аллеи Логон (Sean В. Carroll, Allen Laughon) [138]
  5.1. Введение. Векторы для экспрессии гибридных белков, содержащих B-галактозидазу [138]
    5.1.1. hgt11 [139]
    5.1.2. Плазмидные векторы семейства pUR [140]
  5.2. Конструирование и клонирование гибридных белков, содержащих B-галактозидазу [141]
    5.2.1. Клонирование гибридных генов в векторе hgt11 [143]
    5.2.2. Клонирование гибридных генов в плазмидах pUR [143]
      5.2.2.1. Подготовка векторной ДНК [143]
      5.2.2.2. Приготовление гетерологичного фрагмента ДНК [144]
      5.2.2.3. Лигирование ДНК плазмид pUR с гетерологичной ДНК и трансформация [144]
    5.2.3. Скрининг клонов hgt11 [144]
      5.2.3.1. Скрининг фаговых клонов на наличие вставок [144]
      5.2.3.2. Скрининг клонов hgt11 на продуцирование гибридных белков [144]
    5.2.4. Скрининг клонов, полученных в плазмидах pUR [145]
      5.2.4.1. Скрининг плазмидных клонов на наличие вставок [145]
      5.2.4.2. Скрининг плазмидных клонов на продуцирование гибридных белков [145]
    5.2.5. Соотношение размера гетерологичного фрагмента и выхода синтезируемого гибридного белка [147]
    5.2.6. Характеристика экспрессируемых гибридных продуктов [147]
  5.3. Экспрессия гибридных генов и очистка синтезируемых продуктов [149]
    5.3.1. Индукция синтеза гибридных белков [151]
      5.3.1.1. Индукция штаммов, лизогенных по hgt11 [151]
      5.3.1.2. Индукция клонов, содержащих плазмиду pUR с гибридными генами [153]
    5.3.2. Осаждение клеток и выделение гибридного белка [153]
    5.3.3. Выделение гибридного белка — выбор метода [155]
      5.3.3.1. Препаративный ДСН-электрофорез в ПААГ гибридных белков [155]
      5.3.3.2. Выделение гибридных белков иммуноаффинными методами [157]
      5.3.3.3. Хроматография гибридных белков методом гельфильтрации [158]
      5.3.3.4. Аффинная хроматография на аминофенилтиогалактопиранозиде (АФТГ, APTG) [159]
      5.3.3.5. Заключение по методам очистки гибридных белков [159]
  5.4 Получение и очистка поликлональных антител [161]
    5.4.1. Схемы иммунизации [163]
    5.4.2. Получение антисыворотки и работа с ней [165]
      5.4.2.1. Выделение антисыворотки из крови кролика [165]
      5.4.2.2. Выделение анти-B-галактозидазной фракции антисыворотки [165]
      5.4.2.3. Выделение антител, специфичных по отношению к гетерологичному фрагменту гибридного белка [166]
      5.4.2.4. Определение специфичности антител методом вестериблот-анализа [168]
  Литература [169]
Глава 6. Получение моноклональных антител к гибридным белкам, продуцируемым в клетках Е. coli. Сара Е. Моул, Дэвид П. Лейн (Sara Е. Mole, David P. Lane) [171]
  6.1. Введение [171]
  6.2. Клонирование и экспрессия фрагментов гена [173]
    6.2.1. Конструирование вектора, экспрессирующего гибридный белок [175]
      6.2.1.1. Пример [176]
  6.3. Получение моноклональных антител к гибридным белкам [180]
    6.3.1. Получение антигена [180]
    6.3.2. Иммунизация животных [181]
    6.3.3. Выявление антител к белку, кодируемому клонированным фрагментом ДНК [182]
      6.3.3.1. Примеры [183]
    6.3.4. Скрининг гибридом [185]
    6.3.5. Слияние [187]
      6.3.5.1. Последняя инъекция антигена [188]
      6.3.5.2. Подготовка миеломных клеток [190]
      6.3.5.3. Взятие клеток селезенки донора [190]
      6.3.5.4. Слияние [191]
    6.3.6. Замораживание гибридомных клеточных линий [194]
    6.3.7. Клонирование клеток гибридом [194]
    6.3.8. Загрязнение [195]
  6.4. Применение моноклональных антител [196]
    6.4.1. Очистка моноклональных антител [197]
      6.4.1.1. Подклассы IgG2a, IgG2b, IgG3 [197]
      6.4.1.2. Подкласс IgG1 [198]
    6.4.2. Твердофазный радиоиммуноанализ [199]
    6.4.3. Биотинилирование [199]
    6.4.4. Картирование эпитопов [200]
  6.5. Другие применения: челночное перемещение ЕсоP1-«кассет» с клонированным фрагментом [202]
    6.5.1. Примеры [204]
  Литература [207]
Глава 7. Экспрессия и секреция продуктов гетерологичных генов в дрожжах. Брюс Л. А. Картер, Меил Ирани, Вивиан Л. Маккен, Рои Л. Сил, Анджей В. Следжевски и Роберт А. Смит (Bruce L. A. Carter, Meher Irani, Vivian L. MacKay, Ron L. Searle, Andrzej V. Sledzievski, Robert A. Smith) [208]
  7.1. Введение [208]
    7.1.1. Методы, включенные в данную главу [210]
    7.1.2. Экспрессирующие векторы [210]
    7.1.3. Векторы для экспрессии/секреции [216]
  7.2. Штаммы дрожжей, пригодные для экспрессии и их получение [219]
    7.2.1. Хранение дрожжевых культур [220]
    7.2.2. Конструирование штаммов [221]
      7.2.2.1. Получение диплоидов [221]
      7.2.2.2. Получение гаплоидных спор [222]
      7.2.2.3. Препарирование асков и разделение тетрад аскоспор [223]
  7.3. Трансформация дрожжей [226]
  7.4. Анализ трансформантов [230]
  7.5. Выращивание клеток для осуществления экспрессии и секреции продуктов клонированных генов [233]
  7.6. Приготовление образцов для анализа [234]
  7.7. Анализ дрожжевой экспрессии [236]
  7.8. Очистка рекомбинантных белков, продуцируемых дрожжами [236]
  Литература [237]
Глава 8. Использование амплифицирующихся векторов для экспрессии клонированных генов в клетках млекопитающих. Кристофер Р. Беббингтон и Кристофер К. Г. Хенчель (Christopher R. Bebbington, Christopher С. G. Hentschel) [238]
  8.1. Введение [238]
    8.1.1. Стратегия экспрессии клонированных генов в клетках млекопитающих [238]
    8.1.2. Амплификация генов [239]
    8.1.3. Ко-амплификация и ее использование [241]
    8.1.4. Общая характеристика амплифицирующих векторов [241]
    8.1.5. Методы, описанные в данной главе [245]
  8.2. Методики селекции на амплификацию генов [245]
    8.2.1. Использование в качестве маркера гена дигидрофолят-редуктазы [245]
      8.2.1.1. Селекция в dhfr-клетках СНО [245]
      8.2.1.2. Методика трансфекции DHFR-клеток СНО [246]
      8.2.1.3. Амплификация в присутствии метотрексата [248]
    8.2.2. Использование металлотионеиновых генов [249]
    8.2.3. Амплификация с использованием гена глутамин-синтетазы [251]
      8.2.3.1. Методика селекции векторов, экспрессирующих глутамин-синтетазу [253]
      8.2.3.2. Амплификация gs-векторов [255]
    8.2.4. Аденозин-дезаминазная система [256]
      8.2.4.1. Методика селекции АОА+-клеток [257]
  8.3. Разработка стратегии амплификации [258]
    8.3.1. Стабильность амплифицированного состояния гена [260]
    8.3.2. Строение вектора [261]
    8.3.3. Частота амплификации генов [261]
  8.4. Контроль амплификации генов [262]
    8.4.1. Определение числа копий гена [262]
    8.4.2. Оценка уровня транскрипции [263]
    8.4.3. Оценка эффективности экспрессии белка [264]
    8.4.4. Гибридизация in situ с метафазными хромосомами [270]
  Литература [270]
Глава 9. Ретровирусные векторы. Энтони М. К. Браун и Майкл Р. Д. Скотт (Anthony М. С. Brown, Michael R. D. Scott) [272]
  9.1. Введение [272]
    9.1.1. Почему именно ретровирусы? [272]
    9.1.2. Применение ретровирусных векторов [273]
  9.2. Биология ретровирусов [274]
    9.2.1. Жизненный цикл ретровирусов [274]
    9.2.2. Структура ретровирусного генома и провируса [276]
    9.2.3. Рецепторы, тропизм и иммунность [277]
  9.3. Выбор вектора [278]
    9.3.1. Принципы конструирования векторов [278]
    9.3.2. Векторы, дефектные по репликации [279]
      9.3.2.1. Векторы для одиночных генов [279]
      9.3.2.2. Векторы для спаренных генов [281]
      9.3.2.3. Векторы для экспрессии составных генов [283]
      9.3.2.4. Челночные векторы [284]
      9.3.2.5. Самоинактивирующиеся векторы [285]
    9.3.3. Репликационно-компетентные векторы [285]
    9.3.4. Приготовление вставочных фрагментов ДНК [286]
  9.4. Получение препаратов рекомбинантных вирусов [287]
    9.4.1. Получение препаратов, не содержащих хелперных компонентов [287]
      9.4.1.1. Трансфекция векторной ДНК в упаковывающие клетки [288]
      9.4.1.2. Инфицирование клеток упаковывающих линий [289]
      9.4.1.3. Трансфекция упаковывающей ДНК [291]
    9.4.2 Получение препаратов репликационно-компетентных вирусов [291]
      9.4.2.1. Приготовление препаратов хелперного вируса [291]
      9.4.2.2. Приготовление смешанных препаратов хелперного и рекомбинантного вирусов [291]
    9.4.3. Сбор и хранение вируса; оптимизация условий для повышения титра [293]
  9.5. Инфицирование клеток-мишеней [295]
    9.5.1. Инфицирование с помощью вирусных препаратов [295]
    9.5.2. Инфицирование путем совместного культивирования [295]
  9.6. Контроль вирусных препаратов [297]
    9.6.1. Титрование вируса [297]
      9.6.1.1. Дот-блот-анализ вирусной РНК [297]
      9.6.1.2. Тест на активность обратной транскриптазы [297]
      9.6.1.3. Титрование по частоте трансдукции маркера [298]
    9.6.2. Анализ структуры и экспрессии рекомбинантного вируса [299]
    9.6.3. Выделение провирусной ДНК путем клонирования [300]
      9.6.3.1. Прямое клонирование прозируса в плазмидном векторе [300]
      9.6.3.2. Метод слияния инфицированных клеток с cos-клетками [301]
  9.7. Потенциальные проблемы [301]
    9.7.1. Неэквивалентная экспрессия спаренных генов [303]
    9.7.2. Генетическая нестабильность [304]
  Литература [305]
Глава 10. Получение трансгенных мышей путем микроинъекции клонированной ДНК в оплодотворенные яйцеклетки. Дэвид Мерфи и Дженнифер Хэнсон (David Murphy, Jennifer Hanson) [308]
  10.1. Введение [308]
    10.1.1. Трансгенные животные [308]
    10.1.2. Использование клеток зародышевого пути [308]
      10.1.2.1. Ретровирусы [309]
      10.1.2.2. Эмбриональные стволовые клетки [310]
      10.1.2.3. Микроинъекции [311]
  10.2. Обращение с животными и их содержание [314]
    10.2.1. Содержание животных [314]
    10.2.2. Требования, предъявляемые к животным и оборудованию [315]
      10.2.2.1. Лабораторные животные [315]
      10.2.2.2. Необходимое оборудование [316]
      10.2.2.3. Пипетки для трансплантации яйцеклеток [317]
    10.2.3. Манипуляции с животными [319]
      10.2.3.1. Умерщвление мышей [319]
      10.2.3.3. Анестезирование мышей [319]
      10.2.3.3. Вазэктомия самцов [320]
      10.2.3.4. Скрещивание мышей [321]
      10.2.3.5. Культивирование оплодотворенных мышиных яйцеклеток [324]
      10.2.3.6. Выделение оплодотворенных одноклеточных яйцеклеток [325]
      10.2.3.7. Трансплантация яйцеклеток [329]
      10.2.3.8. Кесарево сечение и вскармливание [332]
  10.3. Микроинъекции [333]
    10.3.1. Оборудование для микроинъекций [333]
      10.3.1.1. Микроскоп [334]
      10.3.1.2. Микроманипуляторы [335]
      10.3.1.3. Инъекционная камера [336]
      10.3.1.4. Изготовление поддерживающих микропипеток [336]
      10.3.1.5. Подготовка инъекционной микропипетки [337]
    10.3.2. Микроинъекция в оплодотворенные одноклеточные яйцеклетки мыши [338]
  10.4. Манипулирование с ДНК [341]
    10.4.1. ДНК для микроинъекции [341]
      10.4.1.1. Физические параметры ДНК [341]
      10.4.1.2. Раствор ДНК [341]
      10.4.1.3. Прокариотические ДНК [342]
      10.4.1.4. Приготовление и очистка препаратов ДНК для микроинъекции [343]
    10.4.2. Идентификация трансгенных мышей [343]
      10.4.2.1. Блот-гибридизационный анализ [343]
      10.4.2.2. Слот (и дот)-блот-анализ [346]
      10.4.2.3. Идентификация гомозиготных трансгенных мышей [347]
  10.5. Разведение трансгенных мышей и анализ экспрессии экзогенных генов [350]
    10.5.1. Получение трансгенных линий [350]
    10.5.2. Экспрессия генов в трансгенных мышах [350]
    10.5.3. Применение трансгенной технологии [351]
  Литература [352]
Список использованных сокращений [354]
Предметный указатель [355]
Формат: djvu
Размер:7143255 байт
Язык:РУС
Рейтинг: 271 Рейтинг
Открыть: