Транскрипция и трансляция. Методы.

Автор(ы):Хеймс Б., Хиггинс С.
06.10.2007
Год изд.:1987
Описание: В книге изложены новые методы изучения экспрессии генов (главным образом эукариот) на уровне транскрипции и трансляции, причем подробное теоретическое обоснование сочетается с тщательным описанием техники работы. По содержанию книга не перекрывается с ранее изданными руководствами по методам генной инженерии. Для специалистов в области молекулярной биологии и биотехнологии.
Оглавление:
Транскрипция и трансляция. Методы. — обложка книги.
Предисловие редактора перевода [5]
Предисловие [7]
Введение Дж. Гердон [8]
Глава 1. Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих. Д. Спандидос, Н. Уилки [10]
  1. Введение [10]
  2. Методы введения ДНК в клетки млекопитающих [11]
    2.1. Кальций-фосфатная методика трансфекции [11]
    2.2. ДЭАЭ-декстрановый метод [24]
    2.3. Микроинъекция [26]
    2.4. Липосомы как переносчики генов [29]
    2.5. Слияние протопластов [31]
    2.6. Другие методы переноса генов [32]
    2.7. Выбор метода переноса генов [32]
  3. Селектируемые маркеры [33]
    3.1. Биохимические маркеры [33]
    3.2. Доминантные трансформирующие гены, изменяющие регуляцию роста [42]
  4. Векторы на основе вирусов [43]
    4.1. Векторные системы на основе литических вирусов [44]
    4.2. Векторные системы на основе ретровирусов [44]
    4.3. Векторы на основе папилломавирусов [45]
  5. Экспрессия перенесенных генов [48]
    5.1. Временная экспрессия [48]
    5.2. Стабильная трансформация [50]
    5.3. Изучение последовательностей, регулирующих транскрипцию [52]
    5.4. Индуцибельные гены [55]
      Благодарности [61]
      Литература [61]
Глава 2. Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus. А. Колмен [65]
  1. Введение [65]
  2. Получение ооцитов и подготовка их к микроинъекции [68]
  3. Микроинъекция ДНК в ядра ооцитов [68]
    3.1. Необходимое оборудование [68]
    3.2. Конформация ДНК, используемой для инъекции [69]
    3.3. Стабильность инъецированной ДНК [69]
    3.4. Концентрация ДНК, используемая для инъекции [69]
    3.5. Заполнение микропипеток раствором ДНК [70]
    3.6. Микроинъекция [70]
  4. Радиоактивное мечение ооцитов после инъекции [74]
    4.1. Мечение РНК, транскрибированной на инъецированной ДНК [74]
    4.2. Мечение белков, кодируемых инъецируемой ДНК [75]
  5. Анализ РНК-транскриптов [75]
    5.1. Выделение РНК [75]
    5.2. Характеристика РНК-транскриптов [77]
    5.3. Идентификация РНК-полимераз, участвующих в транскрипции [84]
  6. Анализ тюсттранскрипциоцного процессинга [85]
  7. Использование системы ооцитов для исследований сопряженной транскрипции — трансляции [86]
  8. Исследование регуляторных белков [87]
      Литература [87]
Глава 3. Транскрипция генов эукариот в бесклеточных экстрактах. Дж. Мэнли [89]
  1. Введение [89]
  2. Получение и использование бесклеточного экстракта для транскрипции РНК-полимеразой II [90]
    2.1. Получение экстракта [90]
    2.2. Реакция транскрипции [92]
    2.3. Выделение РНК [93]
  3. Анализ продуктов транскрипции РНК-полимеразой II [94]
    3.1. Эксперименты с прерванной транскрипцией [94]
    3.2. Ограничения [98]
    3.3. Анализ с помощью гибридизации и расщепления нуклеазой S1 [99]
  4. Оптимизация транскрипционной активности РНК-полимеразы II [101]
    4.1. Подбор концентраций ДНК и экстракта [101]
    4.2. Различия между экстрактами [103]
    4.3. Условия реакции [104]
  5. Посттранскрипционный процессинг молекул — предшественников мРНК [105]
    5.1. Кэпирование и метилирование [105]
    5.2. Сплайсинг [105]
    5.3. Полиаденилирование [105]
  6. Транскрипция в бесклеточных экстрактах при участии РНК-полимераз I и III [108]
      Благодарности [109]
      Литература [109]
Глава 4. Транскрипция РНК в изолированных ядрах. У. Марзлаф и Р. Хуан [111]
  1. Введение [111]
  2. Выделение ядер [112]
    2.1. Введение [112]
    2.2 Основной метод [113]
    2.3. Меры защиты от нуклеаз и протеаз [115]
    2.4. Варианты метода выделения ядер [117]
    2.5. Выделение хроматина с эндогенной РНК-полимеразной активностью [118]
  3. Синтез РНК в изолированных ядрах [119]
    3.1. Условия синтеза РНК [119]
    3.2. Определение активности различных РНК-полимераз [121]
    3.3. Выделение РНК [123]
  4. Общий анализ синтеза РНК [124]
    4.1. Анализ суммарных РНК-продуктов [124]
    4.2. Скорость элонгации [125]
    4.3. Инициация синтеза РНК [127]
  5. Анализ специфических РНК-транскриптов [136]
    5.1. Очистка РНК-транскриптов [136]
    5.2. Количественная оценка специфических РНК-транскриптов [138]
    5.3. Определение размеров специфических РНК-транскриптов [142]
    5.4. Определение концов РНК-транскриптов [145]
  6. Применение систем ядерной транскрипции [147]
    6.1. Измерение относительной скорости транскрипции гена [147]
    6.2. Что такое первичный транскрипт [149]
    6.3. Выделение и изучение первичных транскриптов [150]
    6.4. Изучение посттранскрипционных модификаций [151]
    6.5. Изучение ядерного транспорта зрелой РНК [156]
    6.6. Изучение регуляторных факторов [157]
      Благодарности [157]
      Литература [157]
Глава 5. Транскрипция хроматина. С. Гилмор [160]
  1. Введение [160]
  2. Выделение хроматина [160]
  3. Источник РНК-полимеразы [161]
  4. Оптимальные условия транскрипции in vitro [165]
    4.1. Проблемы, связанные с эндогенной РНК [165]
    4.2. ДНК-зависимая транскрипция хроматина [167]
  5. Анализ РНК-транскриптов [169]
    5.1. Гибридизация со специфическими ДНК-зондами [169]
    5.2. Картирование сайтов инициации транскрипции с помощью нуклеазы S1 [173]
  6. Обоснованность применения РНК-полимеразы Е. coli [180]
  7. Фракционирование и реконструкция хроматина [181]
    7.1. Фракционирование хроматина [181]
    7.2. Реконструкция хроматина [182]
    7.3. Точность реконструкции [183]
      Литература [184]
Глава 6. Прокариотические системы экспрессии генов in vivo. Н. Стоукер, Дж. Пратт, Б. Холланд [186]
  1. Введение [186]
  2. Система клеток-хозяев, облученных УФ-светом [190]
    2.1. Введение [190]
    2.2. Материалы и штаммы [192]
    2.3. Штамм бактерий-хозяев [192]
    2.4. Получение фага [194]
    2.5. Методика введения метки в кодируемые фагом белки [195]
    2.6. Возможные проблемы [197]
    2.7. Использование нелизогенного хозяина [198]
    2.8. Использование фагов с другими областями иммунности [198]
  3. Система мини-клеток [199]
    3.1. Введение [199]
    3.2. Материалы и штаммы [200]
    3.3. Штамм Escherichia coli DS410 — продуцент мини-клеток [200]
    3.4. Подходящие плазмиды [200]
    3.5. Получение мини-клеток [201]
    3.6. Мечение белков, кодируемых плазмидой [205]
    3.7. Возможные проблемы [206]
    3.8. Фракционирование мини-клеток [207]
    3.9. Появление полипептидов-предшественников [207]
    3.10. Заражение мини-клеток бактериофагами [208]
  4. Система макси-клеток [208]
    4.1. Введение [208]
    4.2. Выбор штамма бактерий для получения макси-клеток [208]
    4.3. Подходящие плазмиды [210]
    4.4. Получение макси-клеток [210]
    4.5. Возможные проблемы [212]
  5. Соответствие между генами и их продуктами [213]
      Благодарности [214]
      Литература [214]
Глава 7. Сопряженные Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции. Дж. Пратт [216]
  1. Введение [216]
  2. Получение бесклеточной системы Зьюби [216]
    2.1. Введение [216]
    2.2. Оборудование и реактивы [217]
    2.3. Получение клеток [218]
    2.4. Получение S30-экстракта [221]
    2.5. Оптимизация системы [223]
  3. Получение бесклеточной системы Голда и Швейгера [230]
    3.1. Введение [230]
    3.2. Оборудование и реактивы [230]
    3.3. Получение клеток [230]
    3.4. Получение бесклеточного экстракта [232]
    3.5. Оптимизация системы [233]
    3.6. Модификация основной методики [234]
  4. Использование в качестве матриц ДНК плазмид или фага (?) [234]
    4.1. Экспериментальные подходы [234]
    4.2. Идентификация продуктов клонированных генов [234]
    4.3. Идентификация предшественников белков [237]
    4.4. Исследования регуляции экспрессии генов [240]
  5. Использование линейных ДНК в качестве матриц [241]
    5.1. Экспериментальный подход [241]
    5.2. Значение сверхспирилизации [244]
    5.3. Идентификация химерных белков [245]
    5.4. Идентификация продуктов клонированных генов, сходных по размеру с белками, кодируемыми вектором [246]
    5.5. Идентификация генов, клонированных со своими собственными промоторами [248]
    5.6. Идентификация сайтов рестрикции внутри генов и между генами [249]
    5.7. Анализ ДНК в гетерологичных системах [249]
    5.8. Экспрессия эукариотических генов [249]
  6. Сравнение систем транскрипции — трансляции in vitro [250]
    6.1. Достоинства и недостатки модифицированной системы Зьюби [250]
    6.2. Достоинства и недостатки системы Голда и Швейгера [250]
  7. Преимущества системы in vitro по сравнению с системами in vivo [251]
  8. Возможные проблемы при использовании систем in vitro [251]
      Благодарности [252]
      Литература [252]
Глава 8. Выделение эукариотической матричной РНК (мРНК). М. Клеменс [254]
  1. Введение [254]
  2. Выделение и очистка матричной РНК [254]
    2.1. Оборудование и растворы [255]
    2.2. Выбор метода выделения РНК [257]
    2.3. Выделение РНК из целых клеток или цитоплазматических фракций [257]
    2.4. Выделение полисомной РНК [262]
    2.5. Выделение вирусной РНК [268]
    2.6. Фракционирование РНК [270]
    2.7. Ингибиторы рибонуклеаз [274]
      Благодарности [275]
      Литература [275]
Глава 9. Трансляция эукариотических матричных РНК в бесклеточных экстрактах. М. Клеменс [277]
  1. Введение [277]
  2. Лизат ретикулоцитов [277]
    2.1. Приготовление и хранение лизата [278]
    2.2. Оптимизация активности [280]
    2.3. Условия инкубации для синтеза белка [281]
    2.4. Обработка микрококковой нуклеазой [285]
    2.5. Достоинства и недостатки [288]
  3. Экстракты зародышей пшеницы [290]
    3.1. Приготовлене и хранение экстрактов [290]
    3.2. Условия инкубации для синтеза белка [291]
    3.3. Обработка микрококковой нуклеазой [293]
    3.4. Преимущества и недостатки [293]
  4. Другие эукариотические бесклеточные системы [294]
    4.1. Получение экстрактов клеток асцитной опухоли Эрлиха [295]
    4.2. Предынкубация клеточных экстрактов [296]
    4.3. Условия инкубации для синтеза белка [296]
    4.4. Обработка микрококковой нуклеазой [299]
    4.5. Другие бесклеточные системы [299]
    4.6. Достоинства и недостатки бесклеточных систем культивируемых клеток [299]
  5. Анализ продуктов трансляции [301]
    5.1. Стимуляция включения аминокислот [301]
    5.2. Электрофорез в ПААГ —ДСН [302]
    5.3. Иммунопреципитация продуктов трансляции [303]
    5.4. Анализ триптических пептидов [305]
    5.5. Расшифровка аминокислотной последовательности [308]
    5.6. Анализ биологической активности [308]
  6. Процессинг продуктов трансляции [309]
    6.1. Сигнальные последовательности [309]
    6.2. Протеолиз первичных продуктов [313]
  7. Исследование регуляции трансляции с помощью бесклеточных систем [314]
    7.1. Лизат ретикулоцитов [314]
    7.2. Экстракты культур клеток и тканей [320]
      Благодарности [324]
      Литература [325]
Глава 10. Трансляция эукариотической матричной РНК в ооцитах Хеnopus. А. Колмен [327]
  1. Введение [327]
  2. Получение и подготовка ооцитов для микроинъекций [331]
    2.1. Покупка и содержание Xenopus laevis [331]
    2.2. Извлечение ткани яичника из Xenopus [332]
    2.3. Подготовка ооцитов к инъекции [334]
  3. Микроинъекции мРНК в ооциты [336]
    3.1. Необходимое оборудование [336]
    3.2. Изготовление, калибровка и хранение микропипеток [340]
    3.3. Микроинъекции матричной РНК [343]
  4. Культивирование ооцитов после инъекции и введение в них радиоактивной метки [346]
    4.1. Среда для культивирования [346]
    4.2. Выбор радиоактивных аминокислот [346]
    4.3. Другие радиоактивные предшественники [348]
    4.4. Выбор времени мечения [348]
    4.5. Процедура мечения ооцитов [349]
  5. Сбор, фракционирование и анализ ооцитов и инкубационной среды после культивирования [349]
    5.1. Разделение ооцитов и инкубационной среды после инкубации [350]
    5.2. Гомогенизация ооцитов [350]
    5.3. Фракционирование ооцитов с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы [350]
    5.4. Обработка инкубационной среды [352]
    5.5. Иммунопреципитация [352]
    5.6. Алкилирование и анализ белков с помощью электрофореза в ПААГ—ДСН в восстанавливающих условиях [353]
    5.7. Частичное алкилирование и анализ в ПААГ—ДСН без восстановления [353]
    5.8. Двумерный гель-электрофорез [354]
  6. Специальные методы [356]
    6.1. Энуклеация ооцитов [356]
    6.2. Ингибирование трансляции [358]
    6.3. Ингибирование посттрансляционной модификации [358]
    6.4. Эксперименты по защите от протеаз [359]
  7. Использование системы ооцитов [360]
      Литература [362]
Приложение I. Маркеры молекулярной массы нуклеиновых кислот и полипептидов. С. Минтер и П. Сила [365]
  1. Маркеры ДНК [365]
    1.1. Плазмида pBR322 [365]
    1.2. Плазмида рАТ153 [365]
    1.3. Бактериофаг Лямбда (?) [365]
    1.4. Обезьяний вирус 40 (SV40) [369]
    1.5. Колифаг М13mр7 [371]
    1.6. Бактериофаг (?)X174 [371]
    1.7. Колифаг fd [371]
  2. Маркеры РНК [371]
  3. Маркеры молекулярной массы полипептидов [371]
      Литература [376]
Приложение II. Фирмы — поставщики оборудования и реактивов [378]
Список сокращений [381]
Список авторов [382]
Предметный указатель [383]
Формат: djvu
Размер:5769843 байт
Язык:RUS
Рейтинг: 315 Рейтинг
Открыть: